神经退行性疾病 （NDD），如阿尔茨海默病 （AD）、帕金森病 （PD）、亨廷顿病 （HD）、肌萎缩侧索硬化症 （ALS） 和额颞叶痴呆 （FTD），是与年龄相关的毁灭性脑部疾病。已经做出了重大努力来揭示 NDD 的分子和细胞致病机制。然而，我们对介导 NDD 和相关症状特征的神经回路机制的理解受到技术限制的阻碍。我们无法在 NDD 中优先靶向的皮层下大脑区域中纵向识别和跟踪单个神经元，这给我们对 NDD 的了解留下了巨大的漏洞。微型荧光显微镜（微型显微镜）的最新发展和进步为检查自由移动的啮齿动物深部大脑结构中数百个细胞的空间和时间协调活动开辟了新的途径。在本小型综述中，我们研究了当前和未来微型显微镜工具的功能，并讨论了微型显微镜成像技术的创新应用，这些技术可以将我们对 NDD 神经回路机制的理解扩展到新的领域。
东莞富临医疗科技有限公司是Miniscope专家，我们为中国客户提供：Miniscope 微型荧光显微镜产品与解决方案。
一、引言
展开剩余91%神经退行性疾病（NDDs），如阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）、肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶痴呆（FTD），是普遍且极具毁灭性的疾病。据估计，仅在美国就有约600万人受NDDs影响。大多数NDDs的共同风险因素是年龄增长，随着全球老年人口的增加，预计未来几年全球病例数将迅速上升。尽管在研究NDDs方面投入了大量努力，取得了对这些疾病的基本认识，但NDDs的神经生物学基础仍未被充分理解。由于知识有限，目前开发的治疗干预措施只能延缓病情恶化，为症状提供暂时缓解，但仍迫切需要改善治疗手段。
尽管NDDs各自影响特定的神经元亚群，但不同蛋白质基宏观沉积物的积累导致神经元丢失是NDDs的共同标志。与神经元丢失并行的是，突触功能障碍、钙稳态失调、异常神经活动、神经可塑性异常以及大规模神经回路受损是许多NDDs的常见特征，这些特征表明异常蛋白质沉积、神经元丢失和功能失调神经网络之间的相互依赖性仍有待确定。然而，越来越多的证据表明，许多NDDs中的神经功能障碍可能反映了神经回路的功能障碍，而不是神经元丢失，这表明针对可逆的神经回路具有治疗潜力，值得深入研究。
由于在自由活动动物中对皮层下脑区大规模神经元群体进行纵向研究存在技术挑战，我们对NDDs及其相关症状背后的神经回路机制的理解仍然有限。在本篇简评中，我们聚焦于微型荧光显微镜（miniscope）这一新近发展的体内钙成像技术，探讨其在揭示NDDs发病机制中功能失调神经回路方面的潜力。我们首先简要回顾miniscope的发展历程，然后描述miniscope的特定能力及其在NDDs模型中研究微回路功能障碍的潜在应用。
图1.Miniscope。（A）Miniscope和梯度折射率（GRIN）透镜系统的基本组成部分。（B）安装在自由活动动物上的Miniscope示意图，GRIN透镜指向深脑结构中用遗传编码钙指示剂（GECI）标记的细胞。GRIN，梯度折射率透镜；GECI，遗传编码钙指示剂。
二、Miniscope的简要发展历史
如果没有钙指示剂，利用显微镜观察体内钙瞬变是不可能的。遗传编码钙指示剂（GECIs），特别是GCaMP系列GECIs，已被证明是极其重要的工具，并在定义钙成像能够实现的目标方面发挥了重要作用。钙传感器的持续进步不断突破当前限制，随着活动传感器不仅限于钙，还包括电压、神经递质和离子传感器，荧光显微镜的未来将大不相同（表1）。
表 1.选定的遗传编码指标。
与荧光活性报告器的进步相呼应的是成像仪器的发展。自双光子显微镜技术发展以来，研究钙活动的研究显著增加。通过在固定头部的动物中通过颅窗成像皮层活动，结合各种行为，为理解神经元编码行为提供了许多新见解。梯度折射率（GRIN）透镜的出现，能够将图像从一端传递到另一端，为大脑提供光学接口，使得对深脑区的内窥镜成像成为可能。随后，纤维光学基础显微镜和具有双光子或落射荧光光源的微型荧光显微镜的发展，使得在自由活动动物中观察行为期间的神经活动成为可能。
第一个miniscope具有许多独特的特点。Miniscope是头戴式的，荧光激发和检测是在显微镜上而不是远离显微镜进行的，并且通过使用现成且廉价的技术，绕开了桌面设置的成本限制。Miniscope具有许多独特的优势，包括能够进行细胞类型特异性的、大规模的（可以记录数百个细胞）和纵向的（可以记录数月）记录。这些特点为研究NDDs提供了一个独特的工具，因为miniscope可以在动物模型中成像微回路中的细胞，同时发展NDD样病理生理学和行为。
三、自由活动动物的体内深脑成像
许多NDDs的行为表现已经在动物模型中得到模拟，理解编码疾病相关异常行为的微回路可能为揭示NDDs背后的神经生物学提供关键见解。然而，在自由活动动物中观察行为期间的神经活动在技术上一直具有挑战性。使用桌面设置的双光子成像需要头部固定，这限制了其在某些行为测试中的适用性。此外，有研究报道，与自由活动动物相比，头部固定的动物表现出不同的神经活动，表明头部固定和自然条件下的神经相关性存在差异。尽管已经开发出多种仪器用于在自由活动动物中观察行为期间的神经活动，但miniscope提供了一个独特且易于获取、紧凑且经济的选择（表2）。
表 2.开源微型示波器。
另一个技术挑战是获取在许多NDDs中受影响的深脑结构。直到最近，荧光显微镜监测神经元活动在亚细胞分辨率上仅限于约1毫米的浅层深度。这是由于组织中发生的光散射，以及去除覆盖组织以获取感兴趣结构的光学通路时发生的组织损伤和炎症反应。使用内窥镜技术对深脑结构中的神经元进行成像更为实用，这包括将透镜插入大脑。使用较小直径的GRIN透镜可以减少组织损伤，并最小化对行为的影响，这可以通过使用机器人手术器械进一步改善。
四、纵向追踪单个细胞以研究NDDs
衰老是许多NDDs的主要风险因素。尽管每种NDD都表现出独特的时空退化模式，但这些疾病通常缓慢的进展为研究人员提供了研究的挑战。与年龄相关的退化的主要原因是疾病特异性错误折叠蛋白的积累，导致神经元功能逐渐丧失。然而，在大多数NDDs中也观察到了神经和回路活动模式的变化，这些变化被认为有助于疾病的发病和进展。
五、NDDs早期阶段的过度兴奋性
在许多NDDs中观察到过度兴奋性。在肌萎缩侧索硬化（ALS）患者的临床研究中，皮层和外周过度兴奋性已被广泛记录，并且是ALS患者最早识别的病理之一，也是ALS样病理在啮齿动物模型中早期阶段的特征。因此，假设神经元过度兴奋性是导致ALS中神经元丢失的重要因素。在阿尔茨海默病（AD）中，尽管低活动性是疾病晚期的关键特征，但在AD患者的多个脑区以及AD小鼠模型的海马和皮层区域中，矛盾地观察到了过度活动性，并且增加的神经活动被证明直接促进了淀粉样β（Aβ）肽的产生和分泌，其过度积累似乎在AD中起因果作用。然而，过度兴奋性神经元如何编码行为以及如何促进疾病进展仍然未知。
六、靶向过度兴奋性的治疗潜力
在AD和ALS的小鼠模型中，靶向过度兴奋性已被证明可以改善神经损伤的标志物，并且重要的是，旨在减少海马过度兴奋性的临床试验在患有遗忘性认知障碍的患者中显示出积极效果。ALS最常用的药物利鲁唑减少了大脑中的兴奋性突触活动，而用于晚期AD的美金刚作为一种NMDA受体拮抗剂，对抗过度活跃的谷氨酸能回路。但仍然需要确定这些药物如何影响神经元活动，以提供对疾病相关行为症状的治疗缓解。通过miniscope在自由活动动物中长时间追踪单个神经元的活动，可以为研究微回路中的单个神经元如何编码病理生理行为提供机会。
七、成像特定细胞亚型以研究NDDs
每种NDD都有其独特的退化模式。特定的回路易受影响，特定的细胞亚型在与回路相关的脑区中被靶向。结合转基因啮齿动物品系和/或基因治疗中的细胞类型特异性和诱导型启动子，可以使用miniscope成像特定的神经元亚型和其他脑细胞类型。这一能力为研究NDDs模型中神经元亚型如何编码病理相关行为提供了新的见解。
八、成像多巴胺能、胆碱能和中型棘神经元
帕金森病（PD）症状的出现被认为是由黑质致密部（SNc）多巴胺能神经元的丢失导致基底神经节直接和间接通路的失衡所致。在帕金森病啮齿动物模型中，活动变化与离散神经元群体相关，这些群体可能对帕金森病运动症状的产生和缓解有不同贡献。使用转基因Cre驱动小鼠品系和商业miniscope，Parker等人报告称，在帕金森病小鼠中，直接和间接通路中的中型棘神经元（MSNs）显示出双向放电率变化。MSNs的放电率以及行为异常可以通过给予L-DOPA或多巴胺受体D2激动剂来逆转。尽管这项研究展示了miniscope成像的一些能力，但关于SNc和其他被认为对PD病理有贡献的脑区中的神经元的放电率、模式和同步化仍有许多问题有待解决。
基底神经节中MSNs的选择性易损性是HD的特征。MSNs的独特之处在于，它们不仅接收来自中脑的多巴胺能输入，还接收来自皮层和其他脑区的谷氨酸能输入。直接成像基底神经节中MSNs的活动将为确定可能导致HD中易损性的MSNs的内在特性提供有用线索。
神经调节系统功能障碍与多种NDDs相关，但特定神经调节系统如何在NDD模型中编码行为尚未得到研究。在AD患者的尸检大脑中观察到胆碱能神经元的选择性丢失，胆碱能标记物的减少与PD患者的认知衰退密切相关。重要的是，临床研究表明，胆碱酯酶抑制剂治疗对PD和AD患者都有益处，这表明需要更好地理解胆碱能神经元功能障碍如何对PD、AD和其他NDDs的症状做出贡献。
九、成像特定抑制性中间神经元
γ-氨基丁酸（GABA）在调节神经元兴奋性和维持网络活动平衡中发挥核心作用，抑制性中间神经元功能障碍也对多种NDDs有贡献。抑制性中间神经元功能障碍被认为导致网络过度同步化，这在AD患者中频繁出现的癫痫活动中起作用，因为抑制性中间神经元的缺陷导致AD小鼠模型中的振荡节律受损和网络过度活跃。此外，在AD小鼠模型和AD患者的大脑尸检中描述了抑制性中间神经元亚群的减少。功能障碍的中间神经元也与ALS/FTD模型中的上运动神经元过度兴奋性相关。由于中间神经元受损导致的兴奋/抑制（E/I）失衡被认为可能是AD和ALS以及其他NDDs的潜在共同驱动因素。在NDD模型中使用miniscope成像研究抑制性中间神经元可能会为这一理论提供启示，并提供有关NDD发病机制中抑制性中间神经元的信息。
十、成像特定胶质细胞
多种胶质细胞与神经元有复杂的相互作用以支持其功能，并积极参与神经回路的精细调整。例如，基底神经节中的一组星形胶质细胞释放谷氨酸，选择性激活同型突触以调节神经网络。在HD和ALS中，功能失调的胶质细胞通过非细胞自主毒性促进疾病进展。由慢性免疫反应激活引起的神经炎症通常由小胶质细胞介导，发生在易感区域，并被认为有助于与年龄相关的退化。在许多NDDs中观察到小胶质细胞激活和反应性星形胶质细胞增生，反应性星形胶质细胞失去了许多正常功能并获得了新的异常功能。小胶质细胞和星形胶质细胞的突触消除可能有助于许多NDDs中与认知障碍相关的最早特征之一——突触前终端和树突棘的丢失。胶质细胞可能选择性地移除兴奋性或抑制性突触，以补偿特定脑区的疾病相关变化，或者可能通过直接诱导过度的突触修剪成为E/I失衡的主要驱动因素。通过miniscope钙成像研究胶质细胞活动可能为胶质细胞功能失调如何对NDDs做出贡献提供有用信息。
十一、Miniscope成像的新前沿
当前一代的miniscope为研究NDDs提供了许多令人兴奋的可能性。通过开源共享miniscope项目（表2），miniscope的创新得到了极大的加速，功能改进预示着新的前沿。下一代miniscope和荧光传感器能够同时区分两种神经元亚型、在成像的同时操纵细胞活动、使用非钙指示剂成像细胞事件以及记录电生理特性。
十二、具有光谱可分离波长的GECIs
在NDDs的情况下，同时成像受偏好影响的细胞类型群体以及周围细胞类型将是有利的。这将提供信息，以了解易损细胞群体的功能障碍不仅如何影响行为，还如何影响局部微回路中的其他细胞。具有光谱可分离波长的GECIs的开发提供了同时检查两种不同神经元群体与特定行为相关性的潜力，这可以通过多种方式实现，包括使用Cre-On/Cre-off方法。
具有不同波长的GECIs还提供了同时成像和操纵神经活动的机会。Miniscope成像提供了关于编码行为的神经活动的相关见解，但与成像同时操纵神经活动可以提供关于微回路中细胞群体因果作用的见解。这一任务可以通过使用与荧光活性传感器光谱重叠最小的光驱动通道来实现。也可以使用光遗传学模拟NDDs中观察到的神经元放电失调，同时记录行为期间周围神经元的活动。
十三、非钙荧光活性传感器
荧光成像主要集中在测量细胞内钙瞬变。然而，用于成像的荧光传感器已经开发出来，包括多巴胺瞬变、谷氨酸瞬变、细胞内钾离子浓度和电压信号等，未来还会有更多。许多NDDs表现出多种异常信号，包括多巴胺和谷氨酸功能障碍，这为使用这些尖端传感器研究NDDs提供了大量机会。例如，多巴胺传感器可以用于在黑质中成像多巴胺瞬变，随着多巴胺能神经元的逐渐丢失。
大量证据表明，许多NDDs可能以单个神经元放电模式的改变和回路节点之间的不同步为特征。电生理技术目前提供了无与伦比的时间分辨率，但无法以单神经元分辨率记录动作电位活动的时空动态。荧光成像以高灵敏度推断神经活动，但传统上由于衰减缓慢，无法在高频放电期间准确分辨单个动作电位。电压响应荧光蛋白的工程设计正在迅速发展，有望提供能够显著提高时间分辨率的荧光响应。
十四、结论
能够对大规模群体进行细胞类型特异性的纵向记录，miniscope为NDDs的研究提供了提出新问题和令人兴奋问题的机会。利用miniscope成像的研究在神经科学的各个学科中迅速增加，但在NDD模型中并不常见。我们希望这篇简评，尽管并非详尽无遗，能够引起人们对miniscope成像强大能力的关注，并为在NDDs研究中进行miniscope实验可能回答的问题提供一瞥。
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